PCR体系溶剂蒸发原因分析

在PCR实验中，我们逐一盖好管盖或小心翼翼封膜后，在经过（30～40）次循环、90min左右的等待后，当取出PCR管时，有时会发现某些PCR管内体系明显减少，甚至干掉了，这难免让人沮丧又疑惑：前面做的没啥问题哈，这是为啥呢！

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在PCR实验中，试剂蒸发的现象其实较为常见，循环中体系溶液在高温（95℃左右）下气化，在热盖（默认105℃）的保护下，可以防止水汽在管盖上凝结，但还是会有蒸汽存在于管中，当管盖或覆膜密封不严时，溶液自然会蒸发出去，在反应体系只有几微升时，溶液的挥发影响更大。究其原因主要有以下三点。

1）PCR管

PCR板通常为PP聚丙烯材质，为保证热传导效率，管壁都比较薄，PP的热膨胀系数是热模块的数倍，在热循环中会不断受热、膨胀、变形，当形变严重到影响热盖与管盖的接触时，会引起 PCR 孔板泄漏、溶液蒸发。

市面上PCR仪多种多样，而配套的PCR管（单管、八联管、96孔板等）又是多种多样，很难说相互间的适配性是一定可以得到保证的。性能良好的PCR管可以做到10%的溶剂蒸发率，甚至是3%。尺寸的影响也很明显，PCR管长短不一会出问题，有的PCR管热盖压力不足、管内蒸汽过多会溢出，有的PCR管会被压弯跑完PCR之后会发现管子被压弯变形。

2）人为因素

压盖或封膜时的操作及检查。

对于PCR管盖：压紧管盖后，用指甲盖轻挑一下管盖，如果很轻易挑出缝隙，说明PCR管自身的匹配就不好、密封不严，后续PCR仪热盖压再紧也是于事无补的；而对于封膜，膜本身的材质、厚度、平整度等都会有影响，另外也需要检查确认每个孔位周围的封膜，无褶皱和卷曲等。

PCR循环反应条件的设置。

PCR仪目前大都需手动输入体系的体积，仪器用于模拟控温，当输入体积远高于实际体积时，温度过冲和热平衡时间会加大，高温段停留时间的延长无疑会增加溶液泄漏的风险。

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3）PCR仪热盖

我们以当前常见的可调节式热盖和自适应式热盖说明。可调节式热盖，即热盖高度可以手工调节，便于适配不同的PCR管，但需凭经验手拧调节压力，拧不紧管内溶液会蒸发，拧得过紧也会压坏管子而导致溶液蒸发。其中的力矩式可调热盖则好一些，热盖旋转到一定力矩后会打滑、发出“咔咔”声，热盖的压力可以保持一定。

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自适应式热盖，即热盖自带预压紧的弹簧机构，通过与热盖手柄相结合，在压手柄时可以自动压紧热盖，开手柄时自动松开热盖，对于PCR管的适配性较好。

简而言之，当PCR实验中遇到体系蒸发的现象时，建议还是先检查下自己的操作有无问题,所采用的PCR管耗材有无质量问题，再去排查仪器热盖的压紧力度。